近日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院张天宇教授和马竞副研究员团队关于非综合征型小耳畸形(Nonsyndromic Microtia, NSM)的临床研究成果发表于国际知名学术期刊ACS Omega上 (IF=4.132) 。该研究通过表达谱芯片和TMT蛋白质组学联合分析，揭示了非综合征型小耳畸形中的关键调控基因。中科基因所属南通中科医学检验实验室有限公司作为合作方为本研究提供了测序和个性化的生物信息分析服务，公司资深生物信息分析工程师黄晴晴作为参与人位列共同作者。

     小耳畸形是一种常见的先天性颌面部异常缺陷。在全球范围内， 每10000个新生儿中患病人数约为0.84 - 17.4，仅次于唇腭裂。临床表现为第一、第二鳃弓发育异常引起的外耳、中耳畸形；畸形根据严重程度可分为4度，从轻微结构异常到耳完全缺失。根据是否有其他器官异常，小耳畸形可分为非综合征型（NSM）和综合征型（SM），其中非综合征型占病例的73%。NSM是一种复杂疾病，其病因和发病机制尚不清楚，但普遍认为遗传因素在该疾病中起关键作⽤。该研究通过多组学联合分析，鉴定出了非综合征型小耳畸形中的关键调控基因APOA2、APOC3、A2M 和SERPING1等。

     研究纳入10例NSM和5例正常对照的耳廓软骨样本，结合表达谱芯片和蛋白质组学分析，对非综合征型小耳畸形的关键基因进行了深入研究，主要的研究内容如下：

      本研究共识别出3971个差异表达基因（DEGs）（图1A），其中变化倍数（Fold Change）最大的前20个上调和下调基因如图1B所示。随后对所有差异基因进行功能富集分析，发现上调的DEGs主要参与了神经活性配体-受体相互作⽤、mRNA监测途径和蛋⽩质输出途径（图1C），⽽下调的 DEGs 则富集在溶酶体、破骨细胞分化和磷脂酰肌醇信号系统中（图1D）。

图1 

     为了找到与 NSM 最相关的基因，作者对差异表达DEGs进行了权重基因共表达网络分析（WGCNA），确定了 17 个模块（图2A-C）。根据模块与表型的相关性，筛选出5个模块与NSM表型显著负相关，9个模块与 NSM 显著正相关（图2D）。对所有模块的模块成员资格(MM)与 NSM 之间的相关性进行了探索，基于P < 0.05和相关系数(CC) > 0.5的标准， 发现了9个与NSM最相关的模块。9个模块中深青绿色模块（dark turquoise）显⽰出MM与基因显着性(GS)之间最显著的相关性（相关系数(CC)= 0.82，P = 1.2 × 10-16）。

图2 

     在9个关键模块包含的71个Hub转录因⼦（TFs）中，两个转录因子数据库（hTFtarget和HOCOMOCO）共有19个相同的TFs（图3A）。通过对这19个TFs及其靶基因进行KEGG分析发现（图3-D），棕色模块(Brown)中的基因可能在NSM 中发挥重要作用。

图3

     采用串联质谱标记(TMT)的定量蛋白质组学方法检测各个样品，所有样本中共定量3516 种蛋⽩质。与对照组相⽐，在NSM中鉴定出256种差异表达蛋⽩(DEPs)（包括70个上调和186个下调 DEPs），如⽕⼭图所示（图4A）。按照FC排序的前20个上/下调的DEP展示在热图中（图4B）。为了寻找 DEPs在NSM中的潜在功能，对所有DEPs进行了KEGG富集分析，上调的DEPs主要与⼀些激素相关途径相关（图4C），⽽下调的DEPs在ECM受体相互作⽤和粘着斑通路中富集（图4D）。对下调的DEPs做蛋⽩相互作⽤(PPI)网络分析，发现ITGA2B 可能是其中重要的中枢蛋⽩（图4E）。

图4

     在转录组和蛋白质组联合分析中，总共发现2773个转录本 / 蛋⽩的表达，并且计算了单个基因产物的相关性（图5A），结果显示大部分蛋白与mRNA表达水平之间的相关性较低(R2=0.15)。但在转录水平和蛋白水平上表达均发生显著差异的40个基因之间相关性很高(R2=0.6)（图5B,C）。其中13个基因上调主要参与cAMP和一些激素相关信号通路（图5D），17个下调基因则主要参与ECM−受体反应、粘附、胆固醇代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路（图5E）。然后根据这40个基因绘制出PPI网络，发现APOA2、APOC3、A2M和SERPING为该网络中潜在的关键蛋白（图5F）。

图5

     采用PRM对通过综合分析获得的30个DEPs进行分析，其中13个DEPs（12个下调和1个上调）的验证结果与之前基于TMT的蛋⽩质组学结果吻合（图6）。

图6