随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，肿瘤治疗的模式由经验性指导治疗逐渐走向基因导向的个体化治疗。
近年来,表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）成为肿瘤治疗及抗肿瘤药物研究的热点。EGFR在多种肿瘤细胞中存在突变或扩增的情况,已经检测到的突变数量最多的是非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）。EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）在突变型NSCLC患者的治疗中得到了广泛的应用，因此，在肺癌患者中开展EGFR基因突变检测已成为临床治疗的迫切需求。
目前用于EGFR基因突变检测的主要方法有直接测序法、ARMS、DHPLC、HRM、PCR-SSCP、突变体富集PCR及微滴数字PCR等。下面将对这些检测方法进行简单介绍：
1、直接测序法
直接测序法利用的是Sanger测序法的原理，是目前公认的进行EGFR基因突变检测的金标准。其优势在于相对成本较低，非常直观，可以直接读出DNA的碱基序列，对于已知和未知的突变均可以进行检测。其缺点在于需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高,对环境和操作者有危害。更重要的是直接测序法灵敏度有限，肿瘤组织的突变含量至少达到20%才能被直接测序法检出。
2、焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
焦磷酸测序技术是新一代的DNA序列分析技术，其原理是在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到新合成的DNA链中并释放出焦磷酸基团(PPi)。经过一系列的酶级联化学发光反应，PPi转化为可见光信号，而信号的强度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。因此，无需电泳无需对DNA片段进行荧光标记，就可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其不足在于不如直接测序普及，测序长度短，易污染。
3、探针扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）
原理为：利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变, 设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时，在引物3'端设计一错配碱基，一个与野生DNA 互补，一个与突变DNA 互补，使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增后的PCR产物可通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）进行定量分析。目前已有两种较为成熟的商品化试剂盒问世，一种是英国DxS公司生产的DxS ARMS EGFR检测试剂盒，另一种是我国厦门艾德生物医药科技有限公司生产的Adx ARMS EGFR检测试剂盒，二者均可检测29种常见突变。前者使用的是蝎形探针，后者是双环探针。ARMS法较直接测序法的敏感性更高，其检测结果与临床疗效的一致性更好，纤维支气管镜活检等小标本和血浆或血清标本的EGFR突变检测更适合用ARMS法。但ARMS法需要特殊探针，每次仅能检测一种突变。
4、变性高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)
DHPLC是利用发生错配的杂合双链DNA与纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”，在部分加热变性的条件下，更易于解链形成Y形结构，与固定相的结合能力降低，所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来，通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。与测序法相比，DHPILC简单、快速、敏感性高，不仅可用于已知突变的检测，还可以用于未知突变的扫描。DHPLC不足之处：只能检测有无突变，不能检测出同源突变和突变类型。结果判读容易出错，且当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量。
5、高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting analysis，HRM)
利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列熔解曲线不同，在PCR后直接运行高分辨熔解进行样品突变分析，应用其极高的温度均一性和温度分辨率，可对0.1℃差异进行分辨，使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。每一段DNA，因组成的碱基不同，形成独特的熔解曲线，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的敏感性、特异性、稳定性和重复性。与测序法比较，灵敏度高，可用于体细胞突变的检测和测序前突变的筛选。该方法无需序列特异性探针，也不受突变碱基位点与类型的局限，操作简单，无需PCR后续操作，选择性好。但该法只能分析纯度单一的小片段DNA，且要求有足够的模板，模板含量不少于1ng时能得到稳定可靠的结果。
6、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-Single strand conformation polymorphism analysis，PCR-SSCP)
单链构象多态性是指单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间构象，当碱基发生改变时，单链DNA的会形成不同的构象。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA 因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同。PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳，有碱基插入、缺失或替代突变的单链就会出现不同的电泳条带。与直接测序法相比，PCR-SSCP灵敏性更高，无需特殊仪器，还可以对未知的突变进行检测，但也有其局限性：电泳时间较长，操作步骤比较繁琐，只能进行定性分析且需要平行的标准对照，受实验条件影响较大，容易出现假阴性。
7、突变体富集PCR（mutant-enriched PCR）
突变体富集PCR是一种用限制性内切酶选择性消化野生型EGFR基因的两步法PCR，在第一次PCR 后选择性消化野生型的EGFR 基因，从而使突变的EGFR基因得到富集，然后再进行第二次PCR，最后用电泳检测PCR产物，根据PCR产物的性质（大小或有无）来判断EGFR基因是否发生突变。与直接测序法相比，由于突变体富集PCR有两次PCR扩增，检测EGFR激活突变灵敏性更高，特异性强更强，能从103-104个野生型拷贝中检测到一个突变基因，但该方法也存在明显的不足：需要两次PCR，而且需要酶切，操作复杂、耗时长且容易污染。
8、微数字PCR（microfluidics digital PCR）
微数字PCR是以集成流路（integrated fluidic circuits，IFC）芯片为基础的数字PCR 技术。原理为：将样品作大倍数稀释和细分，直至每个细分试样中所含有的待测分子数不会超过1个，再将每个细分试样同时在相同条件下PCR 后通过基因芯片逐个计数，是一种绝对定量的方法。该方法污染几率小，敏感性可以达到一条DNA链的水平，是目前已知敏感性最高的EGFR基因突变检测方法，尤其适合于肿瘤DNA含量较少的体液类标本的检测。相比于组织学的结果，采用该方法检测血浆标本的敏感性和特异性分别高达92％和100％。该方法的不足在于其成本较高且目前并不普及，对于临床的指导意义还有待进一步的验证。
综上所述，目前直接测序法仍为EGFR基因检测的金标准，但由于其敏感度较低，仅用于组织标本的检测，限制了临床应用。焦磷酸测序法的敏感性在5％-10％，特别适合已知序列的检测，既有与直接测序法类似的直观优势，又可以对突变进行相对定量。突变体富集PCR、HRM、ARMS及微数字PCR的灵敏度和特异性较高，可用于检测血清中微量游离的EGFR 突变基因。这几种方法中，突变体富集PCR需要电泳检测；HRM虽然自动化程度提高，但只能分析纯度单一的小片段DNA，且要求模板含量不少于1ng；而ARMS和微数字PCR相对于其他几种方法，自动化程度大大提高，花费时间更短，操作更简单。随着Scorpion探针、IFC芯片等新技术的不断出现和成熟，ARMS及微数字PCR在临床基因诊断中将会呈现无可比拟的优越性。
目前EGFR突变检测样本主要为组织石蜡切片标本，但是NSCLC患者在确诊时超过70％患者已为ⅢB期、Ⅳ期，大部分失去了手术机会，肿瘤组织难以获取，而这部分患者往往是需要EGFR-TKI治疗的人群。因此，近几年来越来越多的研究用于细胞学及血液样本中EGFR基因的检测，而这些标本往往由于DNA含量的限制，要求检测方法具有很高的灵敏度。所以开发出更多灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法将会在临床EGFR突变检测中有很大的应用前景。
